董愉老师-肾穿病理常见的特殊染色方法

肾穿病理常用的特殊染色技术

①光镜检查     ②电镜检查     ③免疫荧光检查

1、光镜检查（中性甲醛固定）：

①HE染色     ②免疫组化     ③特殊染色     ④分子检测

2、电镜检查（戊二醛固定）：透射电镜检查

3、免疫荧光检查（丙酮固定）：免疫荧光

1、肾穿标本常做的染色：

①常规染色：HE染色

②特殊染色：PASM、PAS、Masson三色

③免疫荧光染色（直接法）：IgG、IgA、IgM、C3、C1q、Fg

2、根据诊断需要选做的染色：

①特殊染色：刚果红（氧化/不氧化）、色素染色、脂肪染色

②免疫荧光：（直接法）K、λ、IgG1-4

（间接法）乙肝、胶原三项、C4d、PLA2R、BKV

根据检查项目（光镜检查、电镜检查、免疫荧光检查）不同需要分别送3份标本：光镜标本、免疫荧光标本、电镜标本

1、肾穿长度：＞12mm为宜

2、肾小球的判别：

①髓质呈暗红色

②皮质颜色稍浅淡，模糊的小红点

③若无肾小球，可要求再次送检

3、取标本要注意不得将组织夹断或夹扁，尽量维持原有的形状

4、锋利的一次性刀片

5、镊子要专用，不得混用

1、荧光：OCT/ZEUS荧光运输液（-20℃或4℃）

（IF）小球数目＞5个

2、光镜：10%中性福尔马林（pH7.0-7.2，室温）

（LM）小球数目＞10个

3、电镜：2.5%戊二醛（4℃）

（EM）小球数目＞2个

注意：肾组织要保持湿润，绝对不可以干涸！床边快速进行切割、固定！

1、最常用的脱水剂

2、脱水能力强

3、使组织硬化

4、与水在任何浓度下互溶

5、与二甲苯互溶

组织收缩的原因：①高浓度乙醇     ②脱水时间     ③温度

如何改善：低→高，70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇，控制温度，不超过40℃

1、二甲苯作为透明剂，既溶于酒精又能溶解石蜡的特性，但不溶于水且挥发性强，具有一定的毒性

2、石蜡的熔点：58-60℃

3、应选择不含杂质、质量好的石蜡，否则影响切片质量（切片有刀痕，难以薄切）

4、浸蜡时间不宜过久，浸蜡温度不宜过高。否则会造成组织脆硬，切片易破碎

1、切出完整切片要做到：①两条组织靠拢     ②组织平整     ③贴平蜡面

2、切片的厚薄直接影响对结果的判读

厚度: ①Masson染色 3 μm

②PASM染色 1 ~2 um

③PAS染色 3 μm

④HE染色 3 μm

⑤刚果红染色 4~5 μm

切片薄才能清晰观察到肾小球基底膜是否发生改变

1、PASM(Periodic acid--silver methenamine)染色步骤：

①切片脱蜡至水，1%高碘酸氧化15min，蒸馏水洗

②8%铬酸水溶液30min，蒸馏水洗

③1%偏重亚硫酸钠处理1分钟，水洗，再用蒸馏水洗3～4次

④浸入加热至60℃的六胺银工作液 ，反应20min，蒸馏水洗终止反应

⑤0.2%氯化金水溶液2min，蒸馏水洗

⑥3%硫代硫酸钠水溶液2min，水洗5分钟

⑦天青石蓝- Mayer苏木素染色各5min，水洗，返蓝

⑧立春红酸性品红液反应1分钟，1%磷钼酸液分化3-5分钟

⑨常规脱水透明，中性树胶封片

2、PASM染色结果---核心染色

肾小球囊壁、肾小球基底膜和肾小管基底膜呈黑色，免疫复合物呈红色，胞核呈蓝色

3、六胺银(PASM)染色注意事项

①六胺银染色是进行性银浸染，不可逆

②温度：达到60℃

③镜下控制反应时间

④用高碘酸和铬酸双重氧化，可使基底膜着色深，基底膜的结构更加清晰

⑤用六胺银工作液浸染切片时，适宜的染色温度为60℃，温度低，基底膜不易着色；温度高，银胺液出现浑浊，玻片和玻璃染色瓶起银镜反应

1、丽春红酸性品红-苯胺蓝法(Masson三色法)染色步骤：

       ①切片脱蜡至水，浸入Bouin氏液一晚，流水冲洗5min，蒸馏水洗

       ②天青石蓝溶液处理5min，水洗

③Mayer苏木素染色各5min，水洗

④1%盐酸乙醇分化，流水冲洗后返蓝10min

⑤丽春红酸性品红液染色10min，蒸馏水稍水洗

⑥1%磷钼酸处理约5min

⑦苯胺蓝（或亮绿）溶液染色5min，1%冰醋酸处理1min

⑧常规脱水透明，中性树胶封片

2、Masson三色染色结果

肾小球囊壁、肾小球和肾小管基底膜、胶原纤维呈蓝色，免疫复合物呈红色，细胞核蓝紫色

3、Masson三色染色注意事项

①前处理推荐：标本 Bouin液 常规脱水包埋切片→Masson染色（效果佳）

固定

10%甲醛常规脱水包埋切片 Bouin液 Masson染色（效果佳）

补充固定

10%甲醛常规脱水包埋切片→Masson染色（效果不佳）

②

苏木素	细胞核的颜色
Weigert铁苏木素	黑褐色
天青石蓝--Mayer苏木素	蓝黑色

Weigert氏铁苏木素：

甲液：苏木素 1g 无水酒精 100ml

乙液：30%三氯化铁液 4ml 蒸馏水 100ml 纯盐酸 1ml

分甲、乙两液需分瓶盛放，不宜配制过多，临用前将两液等份混合使用，而不宜预先混合，否则易氧化沉淀而逐渐失去其染色力

③1%磷钼酸水溶液的作用

a.分化作用：时间要短，镜下控制，胶原纤维被分化成无色或淡红色，肌纤维、纤维素鲜红色

B.媒染作用：使胶原纤维与大分子染料的苯胺蓝液较易结合

④苯胺蓝液后用1%冰醋酸处理，目的是除去附于细胞浆内的蓝色，使染色鲜艳和清晰

⑤苯胺蓝的染色时间一定要控制好，不能过染，否则会遮盖了肌纤维的颜色，造成对比不清晰

⑥如果不用苯胺蓝进行复染，可用亮绿复染,但是亮绿容易褪色

1、PAS染色步骤：

①切片脱蜡至水，1%高碘酸氧化20min

②蒸馏水反复充分水洗，无色品红试剂避光反应20min

③1%偏重亚硫酸钠处理2min；流水冲洗5～10min

④用苏木素浅染胞核；水洗

⑤常规脱水透明，封片

2、PAS染色结果

肾小球囊壁、肾小球和肾小管基底膜、肾小球系膜基质呈紫红色，细胞核呈蓝色

3、PAS染色注意事项

①高碘酸的氧化时间

a.真菌染色： 10min

b.肾基底膜染色：20min

②无色品红的配制：偏重亚硫酸钠的质量要保证（不能潮解，要确认试剂中二氧化硫的气味要足够浓）

③偏重亚硫酸钠在染色作用：洗去无色品红试剂，再用水洗，目的是终止染色，避免背景红染

④使用方法：无色品红液应置于4℃冰箱保存，用前恢复室温。无色品红液可反复使用多次，至溶液出现淡红色时才弃用。切片在用无色品红染色前，要用蒸馏水反复冲洗，避免有自来水带入无色品红试剂，造成无色品红试剂变红，染色力下降。

⑤反应时间：（避光）

a.无色品红试剂染色宜在室温20℃～25℃进行

b.夏季室温高，可缩短染色时间至20分钟

c.冬季室温较低，可延长染色时间至30分钟

1、淀粉样变性肾病是以淀粉样蛋白沉积为特点的代谢性疾病

2、刚果红染色可显示淀粉样蛋白

3、淀粉样蛋白分为：

①AL蛋白（淀粉样轻链蛋白）---- 浆细胞所分泌的免疫球蛋白的轻链

       ②AA蛋白（淀粉样相随蛋白）-----来自血浆中的和免疫球蛋白不相关的蛋白质

4、淀粉样蛋白刚果红染色方法

①、组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋

②、切片厚4µm，常规脱蜡至水

③、甲醇刚果红液染10min，倾去余液

④、碱性乙醇分化，约2s～5s，水洗2次后于镜下控制至合适为度

⑤、流水冲洗5min

⑥、Mayer苏木精浅染胞核

⑦、流水冲洗10min

⑧、常规脱水透明，中性树胶封固

5、淀粉样蛋白染色注意事项

①甲醇刚果红法染色结果颜色鲜艳，结果不易褪色

②甲醇刚果红染液因其甲醇成分，在滴染时染液容易扩散，可采用浸染方式

③凡是用刚果红染淀粉样蛋白，也把甲状腺胶质、弹力纤维等染成红色，应注意区分

④用碱性乙醇分化时要掌握恰当，若分化不足，胶原纤维也着红色；分化过度，淀粉样蛋白也可脱色

⑤如脱色过度，可将切片水洗后由第3步开始重染。因此分化时需要在镜下观察

⑥刚果红染色

A片：常规方法进行刚果红染色

B片：用酸化高锰酸钾氧化后再进行刚果红染色

           ⑦原发性淀粉样变性肾病

              AL蛋白变性（A、B片阳性）：骨髓瘤伴发的淀粉样变性肾病

             局限性淀粉样变性肾病

             AA蛋白变性（A片阳性B片阴性）：继发性淀粉样变性肾病

             地中海家族性淀粉样变性肾病

注：建议配合视频学习，效果更佳。

回放更新时间：6月6日，回放视频观看方式【关注“达科为医疗”公众号，点击达学堂菜单—课后回放进入学习】

病理·达学堂

2020.05.22