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董愉老师-肾穿病理常见的特殊染色方法

肾穿病理常用的特殊染色技术


①光镜检查     ②电镜检查     ③免疫荧光检查


1、光镜检查(中性甲醛固定):

HE染色     ②免疫组化     ③特殊染色     ④分子检测

2、电镜检查(戊二醛固定):透射电镜检查

3、免疫荧光检查(丙酮固定):免疫荧光


1、肾穿标本常做的染色:

①常规染色:HE染色

②特殊染色:PASMPASMasson三色

③免疫荧光染色(直接法):IgGIgAIgMC3C1qFg

2、根据诊断需要选做的染色:

①特殊染色:刚果红(氧化/不氧化)、色素染色、脂肪染色

②免疫荧光:(直接法)K、λ、IgG1-4

(间接法)乙肝、胶原三项、C4dPLA2RBKV


根据检查项目(光镜检查、电镜检查、免疫荧光检查)不同需要分别送3份标本:光镜标本、免疫荧光标本、电镜标本


1、肾穿长度:>12mm为宜

2、肾小球的判别:

①髓质呈暗红色

②皮质颜色稍浅淡,模糊的小红点

③若无肾小球,可要求再次送检

3、取标本要注意不得将组织夹断或夹扁,尽量维持原有的形状

4、锋利的一次性刀片

5、镊子要专用,不得混用


1、荧光:OCT/ZEUS荧光运输液(-20℃或4℃)

IF)小球数目>5

2、光镜:10%中性福尔马林(pH7.0-7.2,室温)

LM)小球数目>10

3、电镜:2.5%戊二醛(4℃)

EM)小球数目>2

注意:肾组织要保持湿润,绝对不可以干涸!床边快速进行切割、固定!


1、最常用的脱水剂

2、脱水能力强

3、使组织硬化

4、与水在任何浓度下互溶

5、与二甲苯互溶

组织收缩的原因:①高浓度乙醇     ②脱水时间     ③温度

如何改善:低→高,70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇,控制温度,不超过40


1、二甲苯作为透明剂,既溶于酒精又能溶解石蜡的特性,但不溶于水且挥发性强,具有一定的毒性

2、石蜡的熔点:58-60℃

3、应选择不含杂质、质量好的石蜡,否则影响切片质量(切片有刀痕,难以薄切)

4、浸蜡时间不宜过久,浸蜡温度不宜过高。否则会造成组织脆硬,切片易破碎


1、切出完整切片要做到:①两条组织靠拢     ②组织平整     ③贴平蜡面

2、切片的厚薄直接影响对结果的判读

厚度: Masson染色 3 μm

②PASM染色 1 ~2 um

③PAS染色 3 μm

④HE染色 3 μm

⑤刚果红染色 4~5 μm

切片薄才能清晰观察到肾小球基底膜是否发生改变


1PASM(Periodic acid--silver methenamine)染色步骤:

①切片脱蜡至水,1%高碘酸氧化15min,蒸馏水洗

8%铬酸水溶液30min,蒸馏水洗

1%偏重亚硫酸钠处理1分钟,水洗,再用蒸馏水洗34

④浸入加热至60℃的六胺银工作液 ,反应20min,蒸馏水洗终止反应

0.2%氯化金水溶液2min,蒸馏水洗

3%硫代硫酸钠水溶液2min,水洗5分钟

⑦天青石蓝- Mayer苏木素染色各5min,水洗,返蓝

⑧立春红酸性品红液反应1分钟,1%磷钼酸液分化3-5分钟

⑨常规脱水透明,中性树胶封片

2PASM染色结果---核心染色

肾小球囊壁、肾小球基底膜和肾小管基底膜呈黑色,免疫复合物呈红色,胞核呈蓝色

3、六胺银(PASM)染色注意事项

①六胺银染色是进行性银浸染,不可逆

②温度:达到60℃

③镜下控制反应时间

④用高碘酸和铬酸双重氧化,可使基底膜着色深,基底膜的结构更加清晰

⑤用六胺银工作液浸染切片时,适宜的染色温度为60℃,温度低,基底膜不易着色;温度高,银胺液出现浑浊,玻片和玻璃染色瓶起银镜反应


1、丽春红酸性品红-苯胺蓝法(Masson三色法)染色步骤:

       ①切片脱蜡至水,浸入Bouin氏液一晚,流水冲洗5min,蒸馏水洗

       ②天青石蓝溶液处理5min,水洗

Mayer苏木素染色各5min,水洗

1%盐酸乙醇分化,流水冲洗后返蓝10min

⑤丽春红酸性品红液染色10min,蒸馏水稍水洗

1%磷钼酸处理约5min

⑦苯胺蓝(或亮绿)溶液染色5min1%冰醋酸处理1min

⑧常规脱水透明,中性树胶封片

2、Masson三色染色结果

肾小球囊壁、肾小球和肾小管基底膜、胶原纤维呈蓝色,免疫复合物呈红色,细胞核蓝紫色

3、Masson三色染色注意事项

①前处理推荐:标本 Bouin 常规脱水包埋切片→Masson染色(效果佳)

固定

10%甲醛常规脱水包埋切片 Bouin Masson染色(效果佳)

补充固定

10%甲醛常规脱水包埋切片→Masson染色(效果不佳)

苏木素

细胞核的颜色

Weigert铁苏木素

黑褐色

天青石蓝--Mayer苏木素

蓝黑色


Weigert氏铁苏木素:

甲液:苏木素 1g 无水酒精 100ml

乙液:30%三氯化铁液 4ml 蒸馏水 100ml 纯盐酸 1ml

分甲、乙两液需分瓶盛放,不宜配制过多,临用前将两液等份混合使用,而不宜预先混合,否则易氧化沉淀而逐渐失去其染色力

1%磷钼酸水溶液的作用

a.分化作用:时间要短,镜下控制,胶原纤维被分化成无色或淡红色,肌纤维、纤维素鲜红色

B.媒染作用:使胶原纤维与大分子染料的苯胺蓝液较易结合

④苯胺蓝液后用1%冰醋酸处理,目的是除去附于细胞浆内的蓝色,使染色鲜艳和清晰

⑤苯胺蓝的染色时间一定要控制好,不能过染,否则会遮盖了肌纤维的颜色,造成对比不清晰

⑥如果不用苯胺蓝进行复染,可用亮绿复染,但是亮绿容易褪色


1PAS染色步骤:

①切片脱蜡至水,1%高碘酸氧化20min

②蒸馏水反复充分水洗,无色品红试剂避光反应20min

1%偏重亚硫酸钠处理2min;流水冲洗510min

④用苏木素浅染胞核;水洗

⑤常规脱水透明,封片

2、PAS染色结果

肾小球囊壁、肾小球和肾小管基底膜、肾小球系膜基质呈紫红色,细胞核呈蓝色

3、PAS染色注意事项

①高碘酸的氧化时间

a.真菌染色: 10min

b.肾基底膜染色:20min

②无色品红的配制:偏重亚硫酸钠的质量要保证(不能潮解,要确认试剂中二氧化硫的气味要足够浓)

③偏重亚硫酸钠在染色作用:洗去无色品红试剂,再用水洗,目的是终止染色,避免背景红染

④使用方法:无色品红液应置于4℃冰箱保存,用前恢复室温。无色品红液可反复使用多次,至溶液出现淡红色时才弃用。切片在用无色品红染色前,要用蒸馏水反复冲洗,避免有自来水带入无色品红试剂,造成无色品红试剂变红,染色力下降。

⑤反应时间:(避光)

a.无色品红试剂染色宜在室温20℃~25℃进行

b.夏季室温高,可缩短染色时间至20分钟

c.冬季室温较低,可延长染色时间至30分钟


1、淀粉样变性肾病是以淀粉样蛋白沉积为特点的代谢性疾病

2、刚果红染色可显示淀粉样蛋白

3、淀粉样蛋白分为:

AL蛋白(淀粉样轻链蛋白)---- 浆细胞所分泌的免疫球蛋白的轻链

       ②AA蛋白(淀粉样相随蛋白)-----来自血浆中的和免疫球蛋白不相关的蛋白质

4、淀粉样蛋白刚果红染色方法

①、组织固定于10%甲醛液,常规脱水包埋

②、切片厚4µm,常规脱蜡至水

③、甲醇刚果红液染10min,倾去余液

④、碱性乙醇分化,约2s~5s,水洗2次后于镜下控制至合适为度

⑤、流水冲洗5min

⑥、Mayer苏木精浅染胞核

⑦、流水冲洗10min

⑧、常规脱水透明,中性树胶封固

5、淀粉样蛋白染色注意事项

①甲醇刚果红法染色结果颜色鲜艳,结果不易褪色

②甲醇刚果红染液因其甲醇成分,在滴染时染液容易扩散,可采用浸染方式

③凡是用刚果红染淀粉样蛋白,也把甲状腺胶质、弹力纤维等染成红色,应注意区分

④用碱性乙醇分化时要掌握恰当,若分化不足,胶原纤维也着红色;分化过度,淀粉样蛋白也可脱色

⑤如脱色过度,可将切片水洗后由第3步开始重染。因此分化时需要在镜下观察

⑥刚果红染色

A片:常规方法进行刚果红染色

B片:用酸化高锰酸钾氧化后再进行刚果红染色

           ⑦原发性淀粉样变性肾病

              AL蛋白变性(A、B片阳性):骨髓瘤伴发的淀粉样变性肾病

             局限性淀粉样变性肾病

             AA蛋白变性(A片阳性B片阴性):继发性淀粉样变性肾病

             地中海家族性淀粉样变性肾病



注:建议配合视频学习,效果更佳。

回放更新时间:6月6日,回放视频观看方式【关注“达科为医疗”公众号,点击达学堂菜单—课后回放进入学习】


病理·达学堂

2020.05.22

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