倪灿荣老师-免疫组化一抗的选择及问题
免疫组化一抗的选择及问题
抗体(antibody,Ab)是机体通过体液免疫，由B淋巴细胞活化、增殖、分化的浆细胞合成并分泌与刺激抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）。
02、抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗体活性。两者在概念上并不完全等同，抗体是生物学和功能上的命名，而Ig是结构和化学本质上的概念。
①由于无抗体活性的Ig一般很少见，故抗体与Ig可认作为同义词。人类Ig有五类(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)是由分子结构中相应的重链（H链）的α.δ.ξ.γ和μ决定；重链不同，Ig的类型就不同。轻链（L链）则在同一抗体分子（Ig）中是相同的，或为κ，或为λ。若轻链不同表明该Ig和抗体是杂系、多克隆的；反之，轻链单一、同型则表示该Ig或抗体是单克隆的。
②Ig单体的基本结构是由二条相同的轻链和二条相同的重链组成，各自链间（轻–重或重–重链）由二硫键（–S–S–）相连接，呈Y字构型。
③Ig分子的氨基酸构型可分为可变区（N-端）和恒定区（C-端）两部分。
①Ig都是大分子蛋白质，既具有免疫原性，又具有能与相应抗原结合的抗体活性。
②免疫原性的类属特异性是由Ig分子的重链和轻链恒定区特定的氨基酸序列所决定，抗体活性位点存在于Ig的可变区。
③Ig由B淋巴细胞衍生的浆细胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于体液中。
④Ig的主要生物学功能有：特异性结合抗原、活化补体、结合Fc受体等。
⑤一个抗体（Ig）分子具有两个结合位点（两价）。
1.多克隆抗体(pAbs) 用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。
2.单克隆抗体(mAb)由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。
3. 基因工程抗体 。
06、噬菌体展示技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。
单克隆抗体
多克隆抗体
特异性
较强
较弱
稳定性
相对较差，对理化条件敏感
较好
对免疫原的要求
不纯的免疫原也能得到高纯度的抗体
免疫原纯度越高越好
标准化
易于标准化，批次间差异小
较难，不同批次的抗体质量差异大
识别
仅检测抗原上的一个表位
能识别多个表位
交叉反应
不易与其它蛋白发生交叉反应
很常见，难避免非特异反应
沉淀和凝集反应
大多数没有
有
制备成本
较高
较低
制备周期
较长
较短
价格
较高
较低
目前商品化抗体已有几千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异(因生产技术、工艺及克隆号之间的差异)，首先应选择一家好的生产公司，根据文献、质控网站提供的信息，以及使用者的经验来选择所需试剂的型号。具有:
1. 国家食品药品安全监督管理局（CFDA）和FDA批准的 伴随诊断检测试剂盒首选。
2. 经NordiQC, UKNEQAS 等全球室间质评评价为最好的抗体才会定义为优质抗体。
3.没有达到最优标准的抗体经过持续改进和重新研发新克隆，并经质控验证Ab1。
4.具有CFDA认证的优先。
5.经国内各级质控机构室间质评评价为最好的抗体优先。
6.兔单抗(rmAb)优先,其次是鼠单抗(mAb) 、兔多抗、鼠多抗等。
1.种属：单克隆抗体，多克隆抗体
2.能否用于石蜡切片
3.稀释度
4.特异性，交叉反应 组织细胞定位
5. 用何种组织前处理方式(HIER/酶消化)
6. 包装单位、价格(性价比)、货号: 、产品号
7. 克隆号(很重要)
8. RTU/浓缩型
9.有效期及保存条件。
1. RTU的优势--方便 稳定 质量高。
2. RTU应注意的问题
①RTU一抗需与实验室的检测平台或检测系统的敏感性相匹配,否则会出现假阳性/假阴性。
②有效期。
③实验室保存条件要求高。
④不同批次RTU Ab1应有预实验/旨。
|
浓缩型一抗 |
Dako Auto/Omnis |
BenchMark XT /Ultra |
Leica Bond III / Max |
|
|
TRS pH 9.0 6.1 |
CC1 8.5 CC2 6.5 |
BERS2 pH 9.0 BERS1 6.1 |
|
pAb clone A0485 |
6/10(60%) 14/20(70%) |
14/20 - |
0/1 2/2 |
|
rmAbclone SP3 |
2/3 - |
2/5 - |
3/12 - |
1、克隆选择不准确或与之相匹配的检测方法(平台)不一致。3+做成2+(HER2-FISH显示信号扩增,比值=3.1-3.7)呈假阴性,占73%(33/46)。
2、假阳性染色结果(6/46)或信噪比低/形态学受损/技术问题(7/46)。
3.、FDA-/CE-IVD批准的HER2 IHC检测途径最为成功。
①一抗体浓度过低。
②mAb克隆4C4.9(Roche/Ventana)的RTU Ab1不成功。
③前处理不充分(温度太低和/或加热时间太短)蛋白质溶前处理或表位HIER遗漏。
④无法解释的技术问题。
阑尾为最佳的阳性和阴性组织对照：外周神经的雪旺细胞，巨噬细胞/树突细胞和脂肪细胞必须中度至强的不同程度的核和质染色。在其他类型细胞，不得出现染色，包括阑尾固有层平滑肌细胞和柱状上皮的肌肉细胞。此外，扁桃体也应作为阳性对照。几乎所有的滤泡间树突细胞和鳞状上皮的朗格汉斯细胞必须表现出中度至强烈的染色强度，滤泡树突状细胞(网)必须至少显示弱至中等但不同的核/细胞质染色反应。
浓缩型Ab1
优
良
级格
不级格
Suff1
Suff1OPS
mAb 4C4.9
0
3
4
0
43%
-
mAb 15E2E2
0
1
1
0
-
-
mAb15E2E2+4C4.9
0
1
0
0
-
-
pAb Z0311 DAKO
62
60
14
1
89%
97%
pAb NCL-LS100P
1
6
3
0
70%
100%
pAb RB-9018-P
0
0
1
0
-
-
pAb RP-035
0
0
1
0
-
-
末知名
0
1
0
0
-
-
RTU
mAb 4C4.9
0
26
18
0
56%
-
rmAb EP32
0
1
0
0
-
-
pAb IS/IR504
0
27
4
0
87%
-
pAb GA504
4
21
1
0
96%
-
pAb 760-2523
0
23
2
3
82%
-
pAb PA0900
0
6
0
0
100%
-
pAb E031
0
1
0
0
-
-
总计(%) 299
67(23%)
178(59%)
49(16%)
5(2%)
浓缩型一抗
pAb Z0311: HIER是关键(高pH值,偏碱)
pAb稀释范围1：1000-1：4000，这取决于IHC检测的总灵敏度。
*(使用该缓冲液的最佳结果/实验室数目)
浓缩Ab1
Dako Link 48
Dako Omnis
Ventana GX/XT/Ultr
Leica Bond III / Max
TRS pH9
TRS pH6
TRS pH9
TRS pH6.1
CC1 pH8.5
CC2pH6
Er2pH9
Er1pH6
pAb Z0311
6/11**
0/1
3/4
-
30/46
-
3/6
0/3
*上述所列的抗体浓度、各系统供应商提供的缓冲液和检测试剂盒。
**(使用该缓冲液的最佳结果/实验室数目)
RTU系统
建议IHC染色设置*
实验室修改的IHC染色设置*
优
良
优
良
Dako pAb IS/IR504
80%（8/10）
0%（0/10）
88%（14/16）
0%（0/16）
Dako Omnis pAb GA504
100%（15/15）
7%（1/15）
83%（5/6）
0%（0/6）
Leica BONDMAX/III
pAb PA0900
0%（0/0）
0%（0/0）
100%（6/6）
0%（0/6）
VMS Ultra/XTpAb 760-2523
100%（6/6）
0%（0/6）
77%（17/22）
0%（0/22）
VMS Ultra/XTmAb 4C4.9
33%（1/3）
0%（0/3）
58%（19/33）
0%（0/33）
*pAb,GA504,Dako,Omnis: 最佳结果的方案:TRS pH9.0(GV804),HIER 30分钟。Ab1 97min和EnVisionFlex（GV800）17min。14/14（100%）实验室产生了足够的染色结果。
19、54%(160/299)的实验室采用实验室内的浓缩抗体 (LD)对S100进行检测。pAb Z0311是应用最广泛的抗体，可用于获得表1和表3所示的最佳染色结果。在LD法中，pAb Z0311的总通过率为89%(122/137)，45%(62/137)为最佳。
1、80%-90%的扁桃体生发中心B-细胞亮区和暗区和绝大多数基底鳞状上皮细胞中有中等至强的核染色反应。
2、胰腺外分泌腺和导管上皮细胞可见散在的中等至强、明显的核染色反应。
3、乳腺癌中适当比例肿瘤细胞的一种中等至强、明显的核染色反应。
4、仅在肝细胞(<1%)有散在核染色反应。
5、无或只有弱背景和细胞质染色反应。
①HIER不充分 ②Ab1浓度过低 ③克隆选择不当
22、mAb克隆：BS4、GM001、K2、MIB-1、UMAB107和rmA克隆：30-9和SP6全部适用于Ki67的可推荐Abs1。有效的HIER是必需的，以获得最佳结果，并且必须被携带以提供灵敏度和保留形态之间的最佳平衡。
RTU克隆：MIB-1(DAKO)，和30-9(Ventana)，显示出略高于实验室开发的Ki67测试的通过率。
正常扁桃体是目前Ki67最值得推荐的阳性组织控制组织。80%-90%的生发中心B-细胞必须表现出中等至强的核反应.尤其是低水平的Ki67必须在亮区B细胞中表达。
浓缩抗体
优
良
级格
不级格
Suff1
Suff/OPS2
mAb clone BS4
1
0
0
0
-
-
mAb clone GM001
1
0
0
0
-
-
mAb clone K2
2
1
0
0
-
-
mAb clone MIB-1
72
36
13
2
88%
90%
mAb clone UMAB107
2
4
1
0
86%
80%
rmAb clone SP6
17
5
1
0
96%
95
pAb RB-1510
1
0
0
0
-
-
RTU
优
良
级格
不级格
Suff1
Suff/OPS2
mAb clone GM001 60-0040-7
1
0
0
0
-
-
mAb clone K2 PA0230
2
2
0
0
-
-
mAb clone Ki88 AM370
0
1
0
0
-
_
mAb MIB-1 IR626/IS626
34
25
5
1
91%
94%
mAb MIB-1 GA626
25
5
1
0
97%
100%
mAb clone MIB-1 AM297
1
0
0
0
-
-
mAb clone MX006 MAB-0672
0
8
1
0
-
-
rmAb clone SP6 275R
2
1
1
0
-
-
rmAb clone SP6 PRM 325
0
1
0
0
-
-
rmAb clone SP6 MAD-000310QD
0
1
0
0
rmAb clone 30.9 790-4286
121
9
1
0
-
总计(%) 299
67(69%)
178(24%)
49(6%)
5(1%)
93%
-
HIER:碱性 20-30min
|
浓缩Ab1 |
Dako平台 |
Ventana平台 |
Leica平台 |
|||||||
|
|
TRS pH9.0 |
TRS pH6.1 |
CC1 pH8.5 |
CC2 pH6.0 |
ER2 pH9.0 |
ER1 pH9.0 |
||||
|
mAb clone MIB-1 |
16/20** |
2/2 |
39/61 |
- |
5/16 |
0/3 |
||||
**(使用该缓冲液的最佳结果/实验室数目)
mAb克隆MIB-1和rmAb克隆SP6是应用最广泛的两种单克隆抗体
63%（150/409个）实验室使用了RTU抗体。使用不同平台其通过率也不一致。
25、P40
①、定位：细胞核,是P63的亚型之一。肺鳞癌:90%表达+,p40与p63敏感性相当，特异性优于p63;肺腺癌中几乎不表达。可用于肺腺/鳞癌的鉴别诊断。
②、Clone#： BC28 、ZR8等。
③、阳性对照组织：肺鳞癌等。
④、HIER方式：EDTA pH9.0 。
⑤、IHC检测系统的选择。
1、几乎所有扁桃体鳞状上皮细胞和前列腺增生腺体衬里基底细胞的一种中等到强的明显的核染色反应。
2、胎盘中分散的滋养层细胞的一种至少弱到中、明显的核染色反应。
3、肺鳞状细胞癌中绝大多数肿瘤细胞呈中等至强、明显的核染色反应。
4、肺腺癌中肿瘤细胞的无染色反应。
5、扁桃体内淋巴细胞等其他细胞的无染色反应。
27、mAb克隆BC28和ZR8可获得p40的最佳染色结果。mAb克隆株BC28是目前应用最广泛、最成功的p40抗体，对浓缩型和RTU型的通过率分别为86%和91% 。
|
浓缩型Ab1 |
优 |
良 |
级格 |
不级格 |
Suff1 |
Suff1OPS |
|
mAbclone BC28 |
52 |
24 |
10 |
2 |
86% |
89% |
|
rmAb clone ZR8 |
1 |
6 |
2 |
5 |
50% |
67% |
|
pAb AC13030 |
0 |
2 |
6 |
0 |
- |
- |
|
pAb RP163 |
0 |
1 |
1 |
3 |
- |
- |
|
pAb PC373 |
0 |
1 |
0 |
3 |
- |
- |
|
pAb RBK054 |
0 |
0 |
1 |
2 |
- |
- |
|
pAb PI049 |
0 |
0 |
1 |
0 |
- |
- |
|
浓缩Ab1 |
Dako Link 48 |
Dako Omnis |
VentanaBenchMark GX |
LeicaBond III / Max |
||||
|
|
TRS Ph9 |
TRS pH6.1 |
TRS pH9 |
TRS pH6.1 |
CC1 pH8.5 |
CC2 pH6 |
Er2 pH9 |
Er1 pH6 |
|
P40,BC28 |
7/20** 35% |
1/1 |
6/8 75% |
1/1 |
30/42 71% |
- |
3/6 50% |
0/1 |
|
RTU系统 |
建议IHC染色流程* |
实验室修改的IHC染色流程** |
||
|
|
足够 |
最佳 |
足够 |
最佳 |
|
DVMS Ultra/XT mAb BC28 790-4950 |
87%（13/15） |
40%（6/15） |
91%（21/23） |
57%（13/23） |
*供应商vendor推荐的协议设置- HIER方法和持续时间、Ab1孵育时间、检测工具包、IHC染色器/设备。
**重大修改：HIER方法、时间和Ab1孵育时间改变>25%。
30、对照
1. 胎盘被推荐作为p40的阳性组织对照，至少必须看到细胞滋养细胞的弱到中度，不同的核染色反应。即使在低放大率(5倍目标)时，细胞滋养层细胞也应该是可见的。
2. 扁桃体支持胎盘，可作为阳性或阴性组织对照。几乎所有鳞状上皮细胞都必须表现出中等至强烈的核染色反应。在其他类型的细胞中不存在核或细胞质染色反应。
评估Lu-ALK染色为最佳的标准包括：
1.间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中几乎所有肿瘤细胞的一种明显的、中等到强的核和细胞质染色反应。
2.伴EMl4-ALK易位肺腺癌中几乎所有肿瘤细胞的至少弱到中度颗粒细胞质染色。
3.默克尔细胞癌中几乎所有肿瘤细胞的至少弱到中度颗粒细胞质染色反应。
4.阑尾神经节细胞和分散轴突的至少弱到中度颗粒细胞质染色反应。
5.无EMl4-ALK易位肺腺癌肿瘤细胞阴性。
6.阑尾和扁桃体上皮细胞阴性。
1、Ab1不太成功(克隆号选择不准确)
2、Ab1浓度太低
3、使用IHC染色平台灵敏度低的检测系统
1、首推mAb OTI1A4 和 rmAb D5F3 伴EMl4-ALK易位肺腺癌检测。 高pH HIER、使用敏感的3步聚合物/2步多聚体检测系统。
2、其次是mAb 5A4,但与mAb OTI1A4和rmAb D5F3相比，灵敏度较低。
浓缩抗体
Dako
Autostainer
Link / Classic
Dako Omnis
Ventana BenchMark XT / Ultra
Leica Bond III / Max
TRS pH 9.0 6.1
TRS pH 9.0 6.1
8.5 6.0
9.0 6.0
mAb clone 5A4
2/8(25%) -
0/3 -
4/13(31%) -
2/5(40%) -
mAb clone OTI1A4 / 1A4
3/3
14/15(93%) -
1/2 -
1/2 -
rmAb clone D5F3
3/4
0/5 -
5/10(50%) -
2/8(25%) -
阑尾被发现是一种有价值和值得推荐的外部阳性组织对照，特别有助于评估分析灵敏度的水平;在几乎所有的Lu-ALK最佳方案中，神经节细胞中出现了弱到强的颗粒细胞质染色反应，轴突中出现了弱到中等的反应。
IMT(炎性肌纤维母细胞肿瘤)由梭形肌纤维母细胞构组成，间质伴有炎症细胞浸润 D5F3（Ventana+BenchMark）：肿瘤细胞弥漫强染色，定位于胞质。
37、小结
①、知道每种一抗的最低表达范围。
②、需设哪几种对照。
③、定位需要准确，可根据说明书提示，蛋白质的生物学功能作出判断。
④、可以用原位杂交的方法互相印证结果的可靠性。
⑤、了解每一种抗体的判断标准。
注：建议配合视频学习，效果更佳。
回放更新时间：6月27日，回放视频观看方式【关注“达科为医疗”公众号，点击达学堂菜单—课后回放进入学习】
病理·达学堂
2020.06.12
